EZ 555 TUNEL細胞(bao)凋(diao)亡檢測(ce)試劑盒（橙紅熒光(guang)）

產品描述(shu)

細(xi)胞凋亡的(de)一個顯著(zhu)特點是細(xi)胞染色體 DNA 的(de)(de)(de)降(jiang)解，這(zhe)是一個較(jiao)普(pu)遍的(de)(de)(de)現象。這(zhe)種降(jiang)解非(fei)常特(te)異(yi)(yi)并有(you)規律，所產生(sheng)的(de)(de)(de)不同長度的(de)(de)(de) DNA 片段(duan)約為(wei) 180 bp-200 bp 的(de)(de)(de)整數(shu)倍，表(biao)現為(wei)瓊脂糖(tang)凝膠電泳中(zhong)呈現特(te)異(yi)(yi)的(de)(de)(de)梯狀 Ladder 圖譜，本試(shi)劑盒采(cai)用 TUNEL 法，應用末(mo)端(duan)脫氧(yang)核糖(tang)核苷酸轉(zhuan)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋(diao)亡細(xi)胞(bao)斷裂(lie)DNA 的(de)(de)(de)3′-OH 末(mo)端(duan)催(cui)化(hua)摻入(ru)(ru)EZ 555-dUTP。EZ 555-dUTP標(biao)記的(de)(de)(de) DNA 可(ke)以用熒(ying)光顯微鏡直接觀察或者(zhe)用流式細(xi)胞(bao)儀定量(liang)。 TUNEL法可(ke)以選擇(ze)性的(de)(de)(de)檢測(ce)凋(diao)亡細(xi)胞(bao)，而非(fei)壞死(si)細(xi)胞(bao)或因輻(fu)照和(he)藥物治療而造成的(de)(de)(de) DNA 鏈斷裂(lie)的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)。TUNEL 實驗中(zhong)， TdT 酶催(cui)化(hua) dUTP 摻入(ru)(ru)斷裂(lie)的(de)(de)(de) DNA 鏈的(de)(de)(de)3′-OH末(mo)端(duan)。抗原標(biao)記的(de)(de)(de) dUTP（如digoxin-dUTP、生*素-dUTP），因為它可以(yi)直接進行原位(wei)檢測，是一種更(geng)快速、直接的檢測手段。

訂購信息(xi)

產品組分

運輸與保存

藍冰運(yun)輸。-20℃避光保(bao)存，有效期24個月(yue)。【注】：避免(mian)反(fan)復凍融。

實驗材(cai)料（自備(bei)）

PBS緩沖(chong)液（1×，pH~7.4）

0.2% Triton X-100（PBS配(pei)制(zhi)）

0.1% Triton X-100（PBS配制，其(qi)中含5 mg/mL BSA）

4%多**醛（PBS配制）

免疫(yi)組化筆

脫蠟溶劑（石(shi)蠟切片樣本）

石蠟切片處理相(xiang)關試劑

抗(kang)熒光淬滅封片劑

ddH₂O

使用方法

一、實驗設(she)計

1. 陽(yang)性(xing)對照(zhao)（可(ke)選(xuan)）：

　　DNase I處理制(zhi)備陽性對照載玻片。DNase I可以消(xiao)化單(dan)鏈或(huo)雙鏈DNA產(chan)生單(dan)脫氧核苷(gan)(gan)酸(suan)或(huo)單(dan)鏈或(huo)雙鏈的寡脫氧核苷(gan)(gan)酸(suan)的核酸(suan)內(nei)切酶(mei)，人為造成細(xi)胞凋亡。

2. 陰性對照（可(ke)選）：

　　使用不含TdT Enzyme的TUNEL Reaction Buffer，用ddH₂O替代TdT Enzyme。

3. 實驗處理組。

4. 實驗對(dui)照組。

二、實驗步(bu)驟(zou)

1. 樣本準(zhun)備：

對于貼(tie)壁(bi)細胞或細胞涂片

（1）PBS清(qing)洗1次。【注】：如果擔心細胞涂(tu)片的(de)細胞貼得不牢，可以(yi)干(gan)燥樣品使(shi)細胞貼得更牢。

（2）固定：加入適(shi)量4%多**醛（PBS配制），室溫固(gu)定(ding)30 min。PBS清洗2次。

（3）通透：加入適(shi)量0.2% Triton X-100（PBS配(pei)制），室溫通透20 min。PBS清洗(xi)2次。

（4）轉步驟2. TUNEL 反應。

對于(yu)懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞或細(xi)胞懸(xuan)液

（1）收(shou)集細胞（ 3-5×10⁶個細胞），1000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。

（2）固定：加入適量4%多**醛（PBS配制）充分(fen)重懸細胞，4℃固定(ding)30 min。2000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。

（3）通透：加入適量0.2% Triton X-100（PBS配制(zhi)），室溫通透(tou)20 min。2000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。

（4）轉(zhuan)步驟2. TUNEL 反(fan)應。

石(shi)蠟組織切片

（1）脫蠟與水(shui)化(hua)：將切片樣本依次放入二甲苯I（10 min）→ 二(er)甲苯(ben)II（10 min）→ 100％乙(yi)(yi)醇I（5 min）→ 100％乙(yi)(yi)醇II（5 min）→ 95%乙(yi)(yi)醇（5 min）→ 90%乙(yi)(yi)醇（5 min）→ 80%乙(yi)(yi)醇（5 min）→ 70%乙(yi)(yi)醇（5 min）→ ddH2O沖(chong)洗5 min，沖(chong)洗2次。【注】：二甲苯(ben)有毒，易(yi)揮發，請在通(tong)風櫥中進(jin)行(xing)此操(cao)作(zuo)。

（2）用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組(zu)化(hua)筆圈(quan)好(hao)樣本輪廓，以便下游通透(tou)與標記。

注：若在后(hou)續(xu)實(shi)驗操作中(zhong)發現免疫組化筆畫的(de)輪廓圈被破壞，需及(ji)時補畫。

（3）通透：按1: 100的比例，將2 mg/mL的Proteinase K溶液(ye)用PBS稀釋至終濃度20 µg/mL，在每個(ge)樣本(ben)上滴加100 µL，使溶液(ye)覆蓋全(quan)部樣本(ben)區域，20-37℃孵育20 min。【注】：Proteinase K可通透(tou)細(xi)胞(bao)膜和核(he)膜，從而使后續步(bu)驟(zou)的(de)(de)染色試劑充分(fen)進(jin)入細(xi)胞(bao)核(he)進(jin)行反應，提高標記(ji)效率。孵(fu)育(yu)時間(jian)(jian)過長會增加(jia)組(zu)織切(qie)片在后續洗滌步(bu)驟(zou)中從載波(bo)片上脫(tuo)落的(de)(de)風險，過短則可能造成透(tou)性處(chu)理不(bu)充分(fen)，影(ying)響標記(ji)效率。為得到更好的(de)(de)結果，Proteinase K的(de)(de)濃度(du)、孵(fu)育(yu)時間(jian)(jian)、溫度(du)需根據不(bu)同類型組(zu)織樣本(ben)進(jin)行優化。

（4）PBS漂洗切片2次，每次5 min，用濾紙吸去多余的液(ye)體，將處理好的樣本放在濕盒(he)中保持濕潤。

注：這一步必須把Proteinase K洗滌干凈(jing)，否則會(hui)嚴重干擾后續的標記反應。

（5）轉步驟2. TUNEL 反(fan)應(ying)。

冰凍組織切片

（1）固(gu)定(ding)：取出冰凍(dong)切片，并回溫(wen)至室(shi)溫(wen)。加(jia)入適量(liang)4%多**醛(quan)（PBS配制），室溫固定30 min。PBS漂洗2次，每次10 min。【注】：若是擔心甲醛清洗不干(gan)凈(jing)，影響(xiang)最終染色效(xiao)果。可(ke)在甲醛固定完(wan)成后加入適量2 mg/mL 甘*酸清洗 10 min，中和殘留的固定液(ye)，再進行(xing)PBS清洗。

（2）用(yong)濾(lv)紙吸干切片樣本(ben)周(zhou)圍液(ye)體，用(yong)免疫組(zu)化筆圈好樣本(ben)輪廓，以便下游(you)通(tong)透與標記。

注：若在后(hou)續實(shi)驗(yan)操作中發現免(mian)疫組化筆畫(hua)的輪廓圈被破壞，需及時補畫(hua)。

（3）通透：按(an)1: 100的(de)(de)比(bi)例，將(jiang)2 mg/mL的(de)(de)Proteinase K溶液用PBS稀釋至(zhi)終(zhong)濃度20 µg/mL，在(zai)每個樣本上滴加100 µL，使(shi)溶液覆蓋全部樣本區域，20-37℃孵育20 min。【注】：Proteinase K可通透細胞(bao)(bao)膜(mo)和核膜(mo)，從(cong)而使(shi)后(hou)續步驟(zou)的(de)染色試(shi)劑(ji)充分進入細胞(bao)(bao)核進行(xing)(xing)反應，提高標(biao)記效(xiao)率。孵育(yu)時(shi)間過(guo)長(chang)會增加(jia)組織切片在(zai)后(hou)續洗(xi)滌步驟(zou)中從(cong)載波片上脫(tuo)落的(de)風險(xian)，過(guo)短則(ze)可能造成透性處理不充分，影(ying)響標(biao)記效(xiao)率。為(wei)得到(dao)更好的(de)結果，Proteinase K的(de)濃度、孵育(yu)時(shi)間、溫(wen)度需根(gen)據不同類型(xing)組織樣本進行(xing)(xing)優化(hua)。

（4）PBS漂洗切片(pian)2次(ci)(ci)，每次(ci)(ci)5 min，用濾紙吸去(qu)多余(yu)的液體(ti)，將處(chu)理好(hao)的樣本放(fang)在濕(shi)盒中保持濕(shi)潤(run)。【注(zhu)】：這一步(bu)必須把(ba)Proteinase K洗滌干凈，否則(ze)會嚴重干擾后續的標(biao)記反應。

（5）轉步(bu)驟2. TUNEL 反應(ying)。

陽性處理（僅(jin)陽性對照進行(xing)(xing)此步驟，其他樣品直(zhi)接(jie)進行(xing)(xing)TUNEL反應步驟(zou)）

（1）按(an)1: 10的比例用ddH2O將10× DNase I Buffer稀釋成(cheng)1× DNase I Buffer備用。

（2）滴加100 µL 1× DNase I Buffer到(dao)已處(chu)理的樣(yang)本(ben)上，覆(fu)蓋全部樣(yang)本(ben)區域，室溫平衡5 min。

（3）用1× DNase I Buffer以1: 100稀釋DNase I (2 U/μL)至終濃度20 U/mL的工作液。

（4）棄去(qu)Buffer，加入(ru)100 μL濃度為20 U/mL的 DNase I工(gong)作液，室溫孵(fu)育(yu)10 min。

（5）棄(qi)去DNase I工作液，PBS清洗2次。

（6）轉步驟2. TUNEL 反應。

2. TUNEL 反應

配制TUNEL反(fan)應液（即用即配）：

對于貼壁細(xi)胞(bao)、細(xi)胞(bao)涂片(pian)或組(zu)織(zhi)切片(pian)

（1）每個樣本加入(ru)50 μL TUNEL反應液，使反應液均勻(yun)覆蓋樣本。37℃避光孵育適宜(yi)的時(shi)間（細胞推薦染色時(shi)間30min-1h，組織染色時(shi)間推薦2h）。【注】：50 μL TUNEL反(fan)應(ying)(ying)液適合涂片(pian)、切片(pian)或(huo)96孔板(ban)（其他不同孔板(ban)可以適當調整TUNEL反(fan)應(ying)(ying)液體(ti)積，覆蓋(gai)(gai)細胞即可）。如(ru)果(guo)待(dai)檢測的(de)樣(yang)品為涂片(pian)、切片(pian)或(huo)在24孔板(ban)、12孔板(ban)或(huo)6孔板(ban)中，可以使用(yong)防蒸(zheng)發(fa)膜，或(huo)自(zi)行(xing)(xing)嘗試使用(yong)自(zi)封(feng)袋或(huo)者其它適當材料自(zi)行(xing)(xing)裁剪成比孔略小的(de)圓(yuan)形塑料片(pian)，滴加(jia)TUNEL反(fan)應(ying)(ying)液后覆蓋(gai)(gai)在樣(yang)品上，可以防止TUNEL反(fan)應(ying)(ying)液蒸(zheng)發(fa)，并(bing)且使TUNEL反(fan)應(ying)(ying)液均勻覆蓋(gai)(gai)樣(yang)本。

（2）棄去TUNEL 反應液(ye)，PBS漂洗2次，每(mei)次5 min。【注】：為了降低(di)背(bei)景，PBS漂(piao)洗切片(pian)1次(ci)(ci)后，可再(zai)用0.1% Triton X-100（PBS配制(zhi)，其中含5 mg/mL BSA）漂(piao)洗3次(ci)(ci)，每次(ci)(ci) 5 min，這(zhe)樣(yang)游離的(de)未反應的(de)標記(ji)物可以清除較干凈。

（3）（可(ke)選）每個樣(yang)本(ben)加(jia)入(ru)適量濃度為5 μg/mL 的DAPI染液，室溫避光(guang)孵育5 min。染色完成后，棄去DAPI染液，PBS漂洗2次(ci)，每次(ci)5 min。

（4）（可(ke)選）切(qie)片封片：將切(qie)片依(yi)次在(zai)純水、70%乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)(chun)、80%乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)(chun)、90%乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)(chun)、95%乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)(chun)、無水乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)(chun)中浸沒(mei)5 min，最后(hou)(hou)將切(qie)(qie)片樣(yang)本(ben)置(zhi)于(yu)染色缸中以(yi)(yi)新鮮(xian)的(de)二(er)甲苯浸泡，透明化處理2次，每次5 min。脫水完成后(hou)(hou)，擦去切(qie)(qie)片周圍的(de)液(ye)體，每個樣(yang)本(ben)滴加50 μL抗熒(ying)光淬滅封(feng)片劑(ji)（抗熒(ying)光淬滅封(feng)片劑(ji)可能會不適用于(yu)某些染料，實驗(yan)前建議進行(xing)預實驗(yan)測試(shi)匹配性），蓋上蓋玻片，用鑷子的(de)鈍端輕輕敲擊(ji)蓋玻片，去除氣泡以(yi)(yi)使封(feng)片。

（5）用濾紙吸去多余的液體(ti)，向(xiang)樣本區域(yu)加100 μL PBS保持(chi)樣本(ben)濕潤，立(li)即在熒光顯微鏡下觀察。

對于(yu)懸(xuan)浮細胞或細胞懸(xuan)液

（1）每(mei)個樣本管加(jia)入(ru)50 μL TUNEL反應液(ye)(ye)輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)重(zhong)懸細胞(bao)，37℃避(bi)光孵育30~60 min。每隔15 min用微量移液(ye)(ye)器輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)重(zhong)懸細胞(bao)。

（2）2000 rpm 離心5 min，棄去TUNEL 反應液(ye)，加(jia)入(ru)適量0.1% Triton X-100（PBS配(pei)制，其中含5 mg/mL BSA）輕輕重懸細胞，并清(qing)洗2次。

（3）每個樣本管加入100 μL濃(nong)度為(wei)5 μg/mL的DAPI染液，室溫避光孵(fu)育5 min。

（4）加入400 μL PBS重(zhong)懸細(xi)胞，立即用流式細(xi)胞儀(yi)檢(jian)測或進行涂片后(hou)在熒光顯微鏡(jing)下觀察。

注意事項

1. 本產品僅限(xian)于(yu)科學實(shi)驗研究使(shi)用，不得用于(yu)臨床診斷、治療等領域。

2. 使用前請將(jiang)產品(pin)瞬時(shi)離心(xin)至(zhi)管底，再進行后續實驗(yan)。

3. 染(ran)色(se)背景(jing)較重或非(fei)特異性著(zhu)色(se)明顯(xian)時可適當減少染(ran)色(se)時間。

4. 實驗時(shi)建議增加陰性(xing)(xing)對照和陽性(xing)(xing)對照組。

5. 組分A使(shi)用時(shi)請佩(pei)戴口(kou)罩、手套，如(ru)接(jie)觸皮膚(fu)，請立即(ji)用大(da)量水沖(chong)洗。

6. 熒光(guang)染料(liao)均(jun)存在淬滅問(wen)題，請盡量注意避光(guang)，以減緩熒光(guang)淬滅。

7. 為(wei)了您的安(an)全和健康，請穿實驗服(fu)并戴一(yi)次(ci)性(xing)手套操作。

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