EZ 640 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(he)（遠紅熒(ying)光(guang)）

產品描(miao)述

細(xi)胞凋亡的一個顯(xian)著特點是細(xi)胞染色(se)體 DNA 的(de)(de)降解，這是一個較普遍(bian)的(de)(de)現象(xiang)。這種降解非常(chang)特異(yi)并有規律，所(suo)產生(sheng)的(de)(de)不同長度的(de)(de) DNA 片(pian)段約為(wei)(wei) 180 bp-200 bp 的(de)(de)整數(shu)倍，表現為(wei)(wei)瓊脂糖凝膠電泳(yong)中呈現特異(yi)的(de)(de)梯狀 Ladder 圖譜，本(ben)試劑(ji)盒采用 TUNEL 法(fa)，應(ying)用末端(duan)脫氧核糖核苷酸轉移(yi)酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在(zai)凋亡細胞(bao)斷(duan)(duan)(duan)裂DNA 的(de)(de)3′-OH 末端(duan)催(cui)化(hua)摻入(ru)(ru)EZ 640-dUTP。 EZ 640-dUTP標記的(de)(de) DNA 可以用熒光顯微鏡(jing)直接觀察或(huo)者用流式(shi)細胞(bao)儀定量。 TUNEL法(fa)可以選擇性的(de)(de)檢測凋亡細胞(bao)， 而非壞(huai)死細胞(bao)或(huo)因輻(fu)照和藥物治(zhi)療而造成的(de)(de) DNA 鏈斷(duan)(duan)(duan)裂的(de)(de)細胞(bao)。TUNEL 實驗中， TdT 酶催(cui)化(hua) dUTP 摻入(ru)(ru)斷(duan)(duan)(duan)裂的(de)(de) DNA 鏈的(de)(de)3′-OH末端(duan)。抗原標記的(de)(de) dUTP（如digoxin-dUTP、生*素-dUTP），因為它可以(yi)直(zhi)接進行原位(wei)檢(jian)測，是一種(zhong)更快速、直(zhi)接的(de)檢(jian)測手段。

訂(ding)購(gou)信息

產品組分

運輸與(yu)保存(cun)

藍(lan)冰(bing)運輸(shu)。-20℃避光保(bao)存，有效(xiao)期24個月(yue)。【注】：避(bi)免反復凍融。

實驗材料（自備）

PBS緩沖液（1×，pH~7.4）

0.2% Triton X-100（PBS配制）

0.1% Triton X-100（PBS配制，其(qi)中(zhong)含(han)5 mg/mL BSA）

4%多**醛（PBS配制(zhi)）

免疫組化(hua)筆

脫蠟(la)溶劑(ji)（石蠟(la)切(qie)片樣本(ben)）

石(shi)蠟(la)切片處理相關試劑(ji)

抗熒光(guang)淬(cui)滅封(feng)片劑

ddH₂O

使用方法

一、實(shi)驗設(she)計

1. 陽性對照（可選）：

　　DNase I處理制(zhi)備陽(yang)性對照載(zai)玻片。DNase I可以(yi)消化單鏈或雙鏈DNA產生單脫氧核(he)苷酸或單鏈或雙鏈的(de)(de)寡脫氧核(he)苷酸的(de)(de)核(he)酸內切(qie)酶，人為造成細胞(bao)凋亡。

2. 陰性對照（可選）：

　　使用不含TdT Enzyme的TUNEL Reaction Buffer，用ddH₂O替代TdT Enzyme。

3. 實驗(yan)處理組。

4. 實(shi)驗對(dui)照組。

二、實驗步(bu)驟(zou)

1. 樣本(ben)準備：

對于貼壁(bi)細胞或(huo)細胞涂片

（1）PBS清洗(xi)1次。【注】：如果擔心細胞涂片的細胞貼得(de)(de)不牢，可以干燥樣品使細胞貼得(de)(de)更牢。

（2）固定：加入適量(liang)4%多**醛(quan)（PBS配制），室溫(wen)固定30 min。PBS清洗2次。

（3）通透：加入(ru)適量0.2% Triton X-100（PBS配制），室溫通透(tou)20 min。PBS清洗2次。

（4）轉步驟(zou)2. TUNEL 反應。

對(dui)于懸浮細胞或細胞懸液

（1）收集細胞(bao)（ 3-5×10⁶個細胞(bao)），1000 rpm離心5 min，PBS清(qing)洗2次。

（2）固定：加(jia)入適量(liang)4%多**醛(quan)（PBS配制）充分重懸細胞，4℃固(gu)定30 min。2000 rpm離心5 min，PBS清(qing)洗2次。

（3）通透：加(jia)入適量0.2% Triton X-100（PBS配(pei)制），室溫通透(tou)20 min。2000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。

（4）轉步驟2. TUNEL 反應。

石蠟組(zu)織切片(pian)

（1）脫蠟與水化：將(jiang)切片樣本(ben)依次放(fang)入二甲苯I（10 min）→ 二甲苯II（10 min）→ 100％乙(yi)(yi)(yi)醇(chun)(chun)I（5 min）→ 100％乙(yi)(yi)(yi)醇(chun)(chun)II（5 min）→ 95%乙(yi)(yi)(yi)醇(chun)(chun)（5 min）→ 90%乙(yi)(yi)(yi)醇(chun)(chun)（5 min）→ 80%乙(yi)(yi)(yi)醇(chun)(chun)（5 min）→ 70%乙(yi)(yi)(yi)醇(chun)(chun)（5 min）→ ddH2O沖洗5 min，沖洗2次。【注】：二甲苯有毒(du)，易(yi)揮(hui)發，請在通風櫥中進行此操作。

（2）用濾紙吸干切片樣本(ben)周圍液體(ti)，用免(mian)疫組化筆圈好樣本(ben)輪(lun)廓，以(yi)便下(xia)游通透(tou)與標記(ji)。

注：若在后續實驗(yan)操作中發現免疫(yi)組化筆(bi)畫(hua)的輪(lun)廓(kuo)圈被破壞，需及時補畫(hua)。

（3）通透：按1: 100的比例(li)，將2 mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀釋(shi)至終濃度20 µg/mL，在每個樣(yang)本上滴加100 µL，使溶液覆蓋(gai)全部樣(yang)本區域，20-37℃孵(fu)育20 min。【注】：Proteinase K可通透(tou)細(xi)胞(bao)膜(mo)和(he)核膜(mo)，從(cong)而使后續(xu)步(bu)(bu)驟的染色試劑充分進入細(xi)胞(bao)核進行(xing)反應，提高標(biao)記(ji)效率。孵育時間(jian)過長會增加(jia)組織(zhi)(zhi)切片在(zai)后續(xu)洗滌步(bu)(bu)驟中從(cong)載(zai)波片上脫落的風險，過短(duan)則可能造成透(tou)性處(chu)理不充分，影(ying)響標(biao)記(ji)效率。為得到更好的結(jie)果，Proteinase K的濃(nong)度、孵育時間(jian)、溫(wen)度需根據不同類型組織(zhi)(zhi)樣本(ben)進行(xing)優化(hua)。

（4）PBS漂洗(xi)切(qie)片2次，每(mei)次5 min，用濾紙吸去多(duo)余的(de)液體，將(jiang)處理好(hao)的(de)樣本(ben)放在濕盒中(zhong)保持(chi)濕潤。

注：這一(yi)步必(bi)須把Proteinase K洗(xi)滌干凈，否則會嚴重(zhong)干擾后續的(de)標記反應(ying)。

（5）轉步驟2. TUNEL 反應。

冰凍組(zu)織切片(pian)

（1）固(gu)定：取(qu)出冰凍(dong)切(qie)片，并回(hui)溫至室(shi)溫。加入適量4%多**醛（PBS配制），室(shi)溫固定(ding)30 min。PBS漂洗2次(ci)(ci)，每(mei)次(ci)(ci)10 min。【注】：若是擔心甲(jia)醛清洗不(bu)干凈，影(ying)響(xiang)最終(zhong)染色效(xiao)果。可(ke)在甲(jia)醛固定完成后加入適(shi)量(liang)2 mg/mL 甘*酸(suan)清洗 10 min，中和殘留的固(gu)定(ding)液，再進行(xing)PBS清洗。

（2）用(yong)濾(lv)紙吸(xi)干切片樣本周圍(wei)液(ye)體，用(yong)免疫組化筆圈(quan)好樣本輪廓，以便下游通透與標記。

注：若在后續實驗操作中發現免疫組(zu)化(hua)筆畫的輪廓圈被(bei)破壞(huai)，需(xu)及時(shi)補畫。

（3）通透：按1: 100的(de)比例，將2 mg/mL的(de)Proteinase K溶(rong)液用PBS稀釋至終濃度20 µg/mL，在(zai)每個(ge)樣本上滴加100 µL，使溶(rong)液覆蓋(gai)全部樣本區(qu)域，20-37℃孵育20 min。【注】：Proteinase K可(ke)通透細胞膜(mo)和核膜(mo)，從而使后續步(bu)驟(zou)的染(ran)色(se)試劑充分進(jin)入細胞核進(jin)行(xing)反應，提(ti)高標(biao)記效(xiao)(xiao)率。孵育時(shi)間過(guo)長會(hui)增加組(zu)織(zhi)(zhi)切片在后續洗滌步(bu)驟(zou)中(zhong)從載波片上脫落的風險，過(guo)短則可(ke)能造成透性處理不充分，影響標(biao)記效(xiao)(xiao)率。為得到更好的結果，Proteinase K的濃度、孵育時(shi)間、溫度需(xu)根據(ju)不同類型組(zu)織(zhi)(zhi)樣本進(jin)行(xing)優化。

（4）PBS漂(piao)洗切(qie)片2次，每次5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理(li)好的樣本放在(zai)濕盒中保持濕潤。【注】：這一步必須把Proteinase K洗(xi)滌(di)干凈，否則會(hui)嚴重(zhong)干擾后續的標記反應。

（5）轉步(bu)驟(zou)2. TUNEL 反應。

陽性(xing)處理（僅陽性(xing)對照進行(xing)此步驟，其他樣(yang)品(pin)直接進行(xing)TUNEL反應(ying)步驟）

（1）按1: 10的比(bi)例用(yong)ddH2O將(jiang)10× DNase I Buffer稀釋成1× DNase I Buffer備用(yong)。

（2）滴加100 µL 1× DNase I Buffer到已(yi)處(chu)理的樣(yang)(yang)本(ben)上，覆蓋(gai)全部樣(yang)(yang)本(ben)區域，室(shi)溫平衡5 min。

（3）用1× DNase I Buffer以1: 100稀(xi)釋DNase I (2 U/μL)至終濃度(du)20 U/mL的工作液。

（4）棄去Buffer，加入(ru)100 μL濃度(du)為20 U/mL的 DNase I工作液，室(shi)溫孵育10 min。

（5）棄去DNase I工作液，PBS清(qing)洗(xi)2次(ci)。

（6）轉步驟2. TUNEL 反(fan)應。

2. TUNEL 反應

配(pei)制TUNEL反(fan)應液（即用即配）：

對(dui)于(yu)貼壁細(xi)胞(bao)、細(xi)胞(bao)涂片或組織切片

（1）每(mei)個樣本加入50 μL TUNEL反(fan)應液，使反(fan)應液均勻(yun)覆(fu)蓋樣本。37℃避光(guang)孵育(yu)適(shi)宜(yi)的時間(jian)（細(xi)胞推薦染色時間(jian)30min-1h，組織染色時間(jian)推薦2h）。【注】：50 μL TUNEL反應(ying)(ying)液(ye)(ye)適合涂(tu)片、切片或96孔板（其他不同孔板可(ke)(ke)(ke)以(yi)適當調整TUNEL反應(ying)(ying)液(ye)(ye)體(ti)積，覆蓋細胞(bao)即可(ke)(ke)(ke)）。如果待檢測的樣(yang)(yang)品為涂(tu)片、切片或在24孔板、12孔板或6孔板中，可(ke)(ke)(ke)以(yi)使用(yong)防蒸發膜，或自(zi)行嘗(chang)試使用(yong)自(zi)封(feng)袋或者其它適當材(cai)料自(zi)行裁剪成(cheng)比孔略小(xiao)的圓形塑料片，滴加(jia)TUNEL反應(ying)(ying)液(ye)(ye)后覆蓋在樣(yang)(yang)品上，可(ke)(ke)(ke)以(yi)防止(zhi)TUNEL反應(ying)(ying)液(ye)(ye)蒸發，并且使TUNEL反應(ying)(ying)液(ye)(ye)均勻覆蓋樣(yang)(yang)本(ben)。

（2）棄去TUNEL 反應(ying)液，PBS漂洗(xi)2次，每次5 min。【注(zhu)】：為(wei)了降低背景，PBS漂(piao)洗切(qie)片1次后，可再用0.1% Triton X-100（PBS配制，其(qi)中含(han)5 mg/mL BSA）漂(piao)洗3次，每次 5 min，這樣游(you)離的(de)未反應的(de)標記物可以清除較干凈。

（3）（可選）每個樣本加入適量(liang)濃度為5 μg/mL 的DAPI染液，室溫避光孵育5 min。染色完成后，棄(qi)去DAPI染液，PBS漂洗2次，每次5 min。

（4）（可選）切片(pian)封片(pian)：將切片(pian)依次在純水、70%乙(yi)(yi)醇、80%乙(yi)(yi)醇、90%乙(yi)(yi)醇、95%乙(yi)(yi)醇、無水(shui)乙(yi)(yi)醇中(zhong)浸(jin)沒5 min，最后將切(qie)片樣本置于染色(se)缸中(zhong)以(yi)新鮮的二(er)甲(jia)苯浸(jin)泡，透明化處理2次，每次5 min。脫(tuo)水(shui)完成后，擦去切(qie)片周圍的液體(ti)，每個樣本滴(di)加50 μL抗(kang)熒光(guang)淬(cui)滅封(feng)片劑（抗(kang)熒光(guang)淬(cui)滅封(feng)片劑可能會不適用于某些染料，實驗(yan)前建議進行預實驗(yan)測試匹(pi)配性(xing)），蓋(gai)(gai)上蓋(gai)(gai)玻(bo)片，用鑷子的鈍端輕輕敲擊(ji)蓋(gai)(gai)玻(bo)片，去除氣泡以(yi)使封(feng)片。

（5）用濾紙(zhi)吸去多余的液(ye)體，向樣(yang)本區(qu)域加100 μL PBS保持樣本(ben)濕潤，立即(ji)在熒(ying)光顯微鏡下(xia)觀察。

對(dui)于懸浮細胞或細胞懸液

（1）每個樣本(ben)管加入50 μL TUNEL反應液(ye)輕輕重(zhong)懸細胞，37℃避光孵育30~60 min。每隔15 min用(yong)微量移液(ye)器(qi)輕輕重(zhong)懸細胞。

（2）2000 rpm 離心(xin)5 min，棄(qi)去TUNEL 反應液，加入適(shi)量0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含(han)5 mg/mL BSA）輕輕重懸細胞，并(bing)清洗(xi)2次。

（3）每個樣本管(guan)加入100 μL濃度為5 μg/mL的DAPI染液(ye)，室溫避(bi)光(guang)孵育5 min。

（4）加(jia)入400 μL PBS重懸細胞(bao)，立(li)即用流式細胞(bao)儀檢測(ce)或進行涂片(pian)后在熒光顯微鏡(jing)下觀察。

注意事項

1. 本產(chan)品僅限于科學實驗研究使(shi)用(yong)，不(bu)得用(yong)于臨床診斷(duan)、治(zhi)療等領(ling)域。

2. 使(shi)用前請將產(chan)品瞬時(shi)離心至管(guan)底(di)，再進(jin)行后續實驗。

3. 染色背景較(jiao)重或非(fei)特異性著色明顯時(shi)可適當減少染色時(shi)間。

4. 實驗時(shi)建議增加陰性(xing)對(dui)照(zhao)(zhao)和(he)陽性(xing)對(dui)照(zhao)(zhao)組。

5. 組分A使用(yong)時請佩戴口罩、手(shou)套，如接觸(chu)皮膚，請立即用(yong)大量水沖(chong)洗(xi)。

6. 熒光染料均存在(zai)淬滅(mie)問題，請盡量注意避光，以(yi)減緩熒光淬滅(mie)。

7. 為了您的安全(quan)和(he)健康，請穿實(shi)驗服并戴(dai)一(yi)次(ci)性手(shou)套操(cao)作。

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